ELISA 原理_类型

原理：

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免   疫活性。② 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（ 测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤   的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体   上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催   化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而   使测定方法达到很高的敏感度。

分类方法：

1. 夹心法：

夹心法常用于检测大分子抗原， 一般的操作步骤为:

1. 1. 将具有专一性的抗体固著（ coating） 于塑胶孔盘上， 完成后洗去多余抗体
   2. 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行  专一性键结
   3. 洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键   结
   4. 洗去多余未键结一次抗体， 加入带有酶的二次抗体， 与一次抗体键结

1. 5. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色  结果

2. 间接法

间接法常用于检测抗体， 一般的操作步骤为：

1. 1. 将已知的抗原固著于塑胶孔盘上， 完成后洗去多余的抗原。
   2. 加入待测检体， 检体中若含有待测的一次抗体， 则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。
   3. 洗去多余待测检体， 加入带有酶的二次抗体， 与待测的一次抗体键结。
   4. 洗去多余未键结二次抗体， 加入酶底物使酶呈色， 藉仪器（ ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（ OD 值）， 以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。

3. 竞争法

竞争法是一种较少用到的 ELISA 检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：

1. 1. 将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上， 完成后洗去多余抗体
   2. 加入待测检体， 使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
   3. 加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于   塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可   键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞   争法之由来。

1. 4. 洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代  表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少， 显色也就越浅。
   5. 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原， 或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时， 一般会考虑使用竞争法 ELISA。

结果判断：

定性测定

定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无" 的简单回答， 分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

在间接法和夹心法 ELISA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反， 阴性孔呈色深于阳性孔。

定量测定

ELISA 操作步骤复杂， 影响反应因素较多， 特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品   在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法 ELISA，标准曲线的范围一般较宽， 曲线最高点的吸光度可接近 2.0， 绘制时常用半对数值， 以检测物的

浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈 S 形， 其头、尾部曲线趋于平坦， 中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。

测定小分子量物质常用竞争法，  其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA 测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系， 这更有利于测定系统的表达。